RU2121501C1

Обновлено: 25.09.2022

Links

Abstract

Использование: общая и прикладная вирусология. Сущность изобретения: для культивирования клеток с целью репродукции парвовирусов плотоядных, получен штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки ПК-91, который прошел 180 пассажей, стабилен и выращивается в монослое в стационарных условиях или во вращающихся флаконах с использованием ростовой среды Игла МЕМ с 4,5% сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 0,5% эмбриональной сыворотки плодов коровы. Штамм клеток ПК-91 депонирован в коллекции ВИЭВ под 49, обеспечивает выход парвовирусного энтерита норок при титровании по РГА от 1:4096 до 1:32768 и парвовируса собак при титровании по РГА 1:256.

Description

Изобретение относится к области общей и прикладной вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей для наработки и изучения вирусов, а также с целью производства противовирусных вакцин.

Известна первичная культура клеток из почки кошки для репродукции парвовирусов плотоядных с целью производства вакцин против парвовирусного энтерита норок на биофабриках России. Данная культура клеток обладает достаточной чувствительностью к парвовирусам плотоядных, обеспечивает выход вируса энтерита плотоядных в титрах реакции гемагглютинации от 1:64 до 1:256, а в отдельных случаях 1:512 - 1:1024.

Однако первичная культура клеток почки кошки при ее использовании для репродукции вирусов имеет ряд недостатков: низкий титр получаемого вируса; необходимость в значительном количестве материала для трипсинизации (постоянный поиск кошек определенного возраста) с целью получения нужных клеток; постоянный контроль на чувствительность и качество получаемых клеток вследствие нестандартности используемого материала; многостадийность процесса получения вируса (трипсинизация, центрифугирование, посев клеток на монослой, инфицирование монослоя, смена среды и т.д.); большой процент брака по стерильности вследствие многостадийности указанной технологии получения вируса; использование в технологии культивирования сыворотки крупного рогатого скота требует проверки этой сыворотки на антивирусную активность.

Перевиваемые культуры клеток выгодно отличаются от первичных культур возможностью работать в стандартных условиях, иметь эталонные производственные заморозки культур клеток, иметь стабильные параметры роста культуры клеток и, как следствие, стабильные результаты при наработке и выделении вируса с более высоким титром.

Известны две перевиваемые клеточные культуры, полученные из почек кошки C81 и F81 для производства вакцин против парвовирусного энтерита норок, в частности для профилактики парвовирусных энтеритов у редких животных (куниц, лисиц, военно-полицейских собак, персидских кошек, тигров, енотов ("Чжунго Кэсюз - Наука Китая". - 1990, с. 399-408). Для культивирования вирусов на указанных культурах клеток используется ростовая среда Игла МЕМ с 10%-ной телячьей сывороткой. Поддерживающая среда содержит (1-4)% телячьей сыворотки. Выход вируса в среднем составляет в реакции гемагглютинации 1:64 - 1: 8192. На клетках успешно культивировались следующие вирусы: парвовирусный энтерит норок (MEV), панлейкемия кошек (FPLV) и собачий парвовирус (CPV).

Недостатком данной перевиваемой клеточной культуры является высокая стоимость компонентов питательной среды, в частности телечьей сыворотки, а также недостаточно высокие средние титры получаемых вирусов.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является перевиваемая культура клеток почки кошки CRFK (Crandell Feline Kidney cell Line), полученная в США и используемая для производства вакцин против парвовирусного энтерита норок (United Vaccines. U.S. Vet. Lic., N 245. - 1990. - p.p. 2-7). Для культивирования вируса используется ростовая и поддерживающая среда Игла MEM с (4-10)%-ной бычьей сывороткой. Культура клеток CRFK обеспечивает выход вируса в титрах реакции гемагглютинации от 1:128 до 1:1024.

Недостатком перевиваемой культуры клеток почки кошки CRFK является недостаточный выход вируса (низкий титр) вследствие ограниченных возможностей указанной культуры клеток и используемой технологии культивирования, кроме того, применение бычьей сыворотки требует проверки на антивирусную активность, а использование Hepes буфера в поддерживающей среде приводит к удорожанию технологии получения вируса.

Задачей предлагаемого технического решения является создание нового стабильного отечественного штамма перевиваемой культуры клеток почки кошки, культивируемого на доступных питательных средах и обеспечивающего репродукцию парвовирусов плотоядных в высоких титрах (для MEV - штаммы "Родники", "Береговой" от 1:4096 до 1:32768 в реакции гемагглютинации, а для CPV - 1: 256).

Поставленная задача решается тем, что получен новый штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки ПК-91 (FK-91 Feline Kidney). Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) под номером 49.

Штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки ПК-91 получают из кортикальной части почек домашней кошки (4-5 месячного возраста). После первичной 3-кратной трипсинизации и общего сбора клеток по общепринятой методике получения первичных культур клеток (В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. Ветеринарная вирусология. - М. : Колос, 1984, с. 372) в количестве 7•10 6 клеток, Оставшиеся кусочки почек были залиты раствором следующего состава: 1 часть 0,02% версена, 1 часть 0,3% трипсина, 1 часть среды 199 и оставлены при температуре +4 + 2 o C на трое суток. Через трое суток кусочки были разбиты (встряхиванием), профильтрованы через 4-слойную марлевую салфетку. Клеточная суспензия отцентрифугирована при 1000 об/мин в течение 10 минут, осадок ресуспендирован в 200 мл ростовой среды: Игла MEM с 10%сыворотки крупного рогатого скота (КРС) и антибиотиками (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 0,1 мг/мл). Готовая суспензия была высажена в 1,5 литровый матрас и помещена в термостат при температуре (36,5 + 0,5) o C, через сутки смена ростовой среды. Через 18 суток вновь смена ростовой среды и еще через шесть суток смена указанной среды на Игла MEM с 10% эмбриональной сыворотки. Через 5 суток (30 суток с начала проведения работ) первый пассаж - рассев 1:2. Второй пассаж через трое суток - рассев 1:2,5. До 8 пассажа используется ростовая среда Игла MEM с 10% эмбриональной сыворотки. С 9 по 11 пассажи - среда Игла MEM с 5% сыворотки КРС и 5% эмбриональной сыворотки. С 12 по 24 пассажи использовалась среда Игла MEM с 8% сыворотки КРС и 2% эмбриональной сыворотки. С 25 по 27 пассажи - среда Игла MEM с 9% сыворотки КРС и 1% эмбриональной сыворотки. С 28 по 30 пассажи - среда Игла MEM с 10% сыворотки КРС. С 31 по 38 пассажи среда Игла MEM с 4% сыворотки КРС, обработанной (ПЭГ) полиэтиленгликолем (Игудин Л.И., Орлов С.Д., Шалунова Н.В. Способ очистки крови крупного рогатого скота. - Вопросы вирусологии, 1990, N 5. - с. 540) и 1% эмбриональной сыворотки. С 39 пассажа использовалась ростовая среда Игла MEM с 4,5% сыворотки КРС, обработанной ПЭГ и 0,5% эмбриональной сыворотки. Эталонное замораживание клеток произведено на 57 пассаже.

Морфологическая характеристика клеток штамма ПК-91. Клетки полиморфные. Ядра овальные различной величины. Ядрышки крупные, от одного до четырех в ядре.

Контроль контаминации. По данным электронно-микроскопического анализа и микробиологического контроля путем высева на набор селективных сред было выяснено, что клетки штамма ПК-91 свободны от вирусной, микоплазменной, грибковой и бактериальной контаминации.

Кариологическая характеристика. По результатам кариологического анализа клеток штамма ПК-91 определены следующие его свойства:
1. Видовая принадлежность. Анализ проведен на метафазных хромосомах, окрашенных по G-методу. Кариограммы хромосом составлены в соответствии с номенклатурой, предложенной Варстер-Хилл и Грей (Wurster-Hill, Gray, Cytogenet. Cell Genet. 12, 377-397, 1973). Установлено: кариотип соответствует виду - Felis catus.

2. Плоидность кариотипа. Проанализировано 1000 клеток на препаратах, приготовленных без выжигания фиксатора на стекле и окрашенных азуром-зозином. Полиплоидные клетки (число хромосом больше 100) составляет 2%.

3. Распределение клеток по числу хромосом. Проанализировано 100 клеток на препаратах, приготовленных без выжигания фиксатора на стекле и окрашенных азуром-эозином.


Стандартные условия выращивания. Для выращивания культуры клеток ПК-91 используют ростовую среду Игла MEM с 4,5% сыворотки КРС, обработанной ПЭГ и 0,5% эмбриональной сыворотки плодов коровы. В качестве антибиотиков используют пенициллин - 100 ед/мл и стрептомицин - 0,1 мг/мл. Температура выращивания: (36,5 + 0,5) o C.

Культуральные свойства. Клетки ПК-91 культивируют в монослое (в стационарных условиях или во вращающихся флаконах). Посевная доза составляет 40-80 тыс. клеток в 1 мл. Кратность рассева: 1:4 - 1:8. Клетки пассируют с частотой 3-4 суток. Для снятия клеток с монослоя используют 0,02% раствор версена (9/10) и 0,125% раствор трипсина (1/10).

Способ криоконсервации. Для криоконсервации клеток используется среда: Игла MEM - 60%, сыворотка эмбриональная плодов коровы - 30%, глицерин - 10% или ДМСО - 7,5%. Режим замораживания клеток осуществляют путем понижения температуры на 1 o C в минуту до -40 o C с последующим их помещением в жидкий азот. Для длительного хранения клеток в жидком азоте при температуре 196 o C используют криопробирки или криоконтейнеры.

Режим оттаивания. Ампулу (контейнер) помещают в воду, подогретую до 37 o C, при постоянном перемешивании. После оттаивания содержимого ампулы ее вскрывают в стерильных условиях. Содержимое ампулы помещают в центрифужный стакан, добавляют ростовой среды 5 частей, центрифугируют при 1000 об/мин 10 минут. Надосадочную жидкость выливают, осадок ресуспендируют в ростовой среде до посадочной концентрации и высевают на матрас (роллер) и помещают в термостат с температурой (36,5 + 0,5) o C до образования монослоя. Перед высевом на матрас берут пробу (0,5 мл) и смешивают 1:1 с 0,2% раствором трипанового синего. Подсчет % жизнеспособных клеток ведут в камере Горяева

Характеристика вируспродукции. Культура клеток ПК-91 обеспечивает выход парвовирусного энтерита норок при титровании по реакции гемагглютинации (РГА) от 1:4096 до 1:32768, а собачьего парвовируса - 1:256. Штамм сохраняет свои свойства по вируспродукции до 180 пассажа (время наблюдения). Тенденции к снижению вируспродукции нет.

Чистую культуру клеток ПК-91, хранящуюся в виде производственных заморозок в жидком азоте, оттаивают, добавляют ростовой среды Игла MEM с 4,5% сыворотки КРС, обработанной ПЭГ, 0,5% эмбриональной сыворотки плодов коровы, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 0,1 мг/мл. Смесь центрифугируют при 1000 об/мин 10 минут. Надосадочную жидкость выливают, осадок ресуспендируют в ростовой среде до посадочной концентрации.

Культуру клеток ПК-91 (FK-91) выращивают на 1,5 литровых матрасах. Посадочная концентрация клеток 0,04•10 6 кл/мл, по 250 мл ростовой среды на 1 матрас. Матрасы с клетками помещают в термостат с температурой (36,5 + 0,5) o C. Монослой клеток образуется на 3-4 сутки. После образования монослоя клеток ростовая среда сливается, монослой ополаскивается раствором для снятия клеток (0,02% раствор версена - 9/10 и 0,125% раствор трипсина - 1/10). При этом клетки отслаиваются от стекла и ресуспендируются в ростовой среде до концентрации (0,4-0,7)•10 6 кл/мл. Часть клеток доводится ростовой средой до посадочной концентрации и рассевается на новые матрасы (чистые клетки). Остальная часть клеток используется для инфицирования парвовирусов плотоядных.

Пример 2. Получение антигена парвовирусного энтерита норок (MEV) на культуре клеток почки кошки ПК-91.

В 400 мл суспензии клеток в концентрации 0,5•10 6 кл/мл общее количество клеток составляет 200 миллионов, что достаточно для приготовления 20 матрасов. В указанный объем суспензии клеток в концентрации 0,5•10 6 кл/мл вводят 3 мл посевного вирусного материала шт. "Родники" или "Береговой" (получен на животных) с титром по РГА 2 18 (1:262144) и суспензию помещают в холодильник с температурой (+4 + 2) o C. По истечению 1 часа клеточную инфицированную суспензию извлекают из холодильника и разводят поддерживающей средой (Игла MEM с 5% сыворотки КРС, обработанной ПЭГ) до посадочной концентрации инфицированных клеток (400 мл разбавляют до 5 литров). После разбавления суспензии титр вируса по РГА в нулевой пробе должен быть 1:64 - 1:128. Далее разбавленную суспензию разливают на 20 матрасов по 250 мл. Матрасы помещают в термостат с температурой (36,5 + 0,5) o C на 6 суток. После этого матрасы подвергаются замораживанию - размораживанию, вирусный материал отделяют от клеток и сливают. Вирусный материал титруют по РГА. Средний титр составляет 2 14 (1: 16384). Затем вирусный материал инактивируют формалином в конечной концентрации 0,1% и используют для приготовления вакцины.

В феврале 1993 г. из Опытно-охотничьего хозяйства по воспроизводству Западно-Сибирских лаек (с. Кубовая, Новосибирской обл.) был передан патматериал (павшая лайка). Из тонкого кишечника был приготовлен 10%-ный гомогенат, который раститрован по РГА с титром 2 16 , идентифицирован в реакции торможения гемагглютинации как парвовирус собак. 10%-ный гомогенат был простерилизован методом стерилизующей фильтрации. Полученным вирусным материалом инфицировали клетки почки кошки ПК-91 (FK-91), как описано в примере 2. Титр вируса в нулевой пробе 2 5 -2 6 (1:32 - 1:64). После культивирования парвовируса собак на матрасах (как описано в примере 2) в течение семи дней титр в РГА составлял 2 8 -2 9 (1:256 - 1:512).

Из изложенного выше видно, что полученный штамм культуры клеток почки кошки ПК-91 (FK-91) стабилен и обладает всеми признаками и качествами, присущими перевиваемым культурам, и по сравнению с известными аналогичными штаммами клеток имеет следующие преимущества. Предлагаемая культура клеток ПК-91 адаптирована к росту на питательных средах, содержащих сыворотку крупного рогатого скота, обработанную полиэтиленгликолем. Указанная сыворотка не обладает противовирусной активностью (т.к. не содержит высокомолекулярной глобулиновой фракции), является доступной и недорогой по сравнению с импортными средами. Кроме того, при получении вирусного продукта клетки вначале инфицируют (концентрация клеток больше чем посадочная в 10 раз), а затем уже инфицированные клетки рассевают на матрасы, то исключает стадию смены среды, которая необходима при инфицировании монослоя, вследствие чего сокращается общее время получения вируса. Инфицированные клетки в суспензии можно хранить до 3-х суток при температуре +4 o C. Полученный штамм культуры клеток ПК-91 позволяет получить по сравнению с аналогами более высокий средний выход вируса (для MEV - штамм "Родники", "Береговой" от 1:4096 до 1:32768 в РГА, а для CPV - 1:256).

Claims ( 1 )

Штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки ПК-91, ВНИИЭВ 49 для репродукции парвовирусов плотоядных.

RU94044703A 1994-12-19 1994-12-19 Штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки пк-91 для репродукции парвовирусов плотоядных RU2121501C1 ( ru )

Выделение вируса на культуре клеток

Культуры клеток пригодны для выделения большинства вирусов животных.

Для этой цели используют как первично-трипсинизированные, так и перевиваемые и диплоидные культуры клеток.

Заражение культур клеток проводят следующим образом. Из пробирок или матрасов с выросшим монослоем клеток удаляют ростовую питательную среду, отмывают монослой клеток от ростовой среды (в ней могут быть антитела к исследуемому вирусу и неспецифические ингибиторы) раствором Хенкса и вносят вируссодержащий материал. После контакта (1—1,5 ч), необходимого для адсорбции вируса на клетках, вируссодержащий материал удаляют и вносят поддерживающую питательную среду, которая не способствует размножению клеток, но обеспечивает их жизнедеятельность. Пробирки и матрасы помещают в термостат для инкубации. Адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают в клетки, репродуцируются в них и выходят в культуральную жидкость, заражают новые клетки, затем следующие и так до тех пор, пока не останется живых клеток.

Обнаружить вирус в клетках можно следующими методами (или признаками):

1) по цитопатическому действию (ЦПД) или цитопатическому эффекту (ЦПЭ). ЦПД — это любые изменения клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Для обнаружения ЦПД зараженные культуры клеток просматривают под малым увеличением светового микроскопа. Формы ЦПД могут быть весьма разнообразными, что зависит от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т. д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2—3 сут после заражения (энтеровирусы), другие — 1—2 нед (аденовирусы). Наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация, округление клеток, симпластобразование.

Фрагментация — разрушение клеток на отдельные фрагменты (вирус везикулярного стоматита и др.).

Округление — клетки принимают шаровидную форму и отделяются от стекла (адено-, пикорнавирусы и др.).

Симпластобразование — образование гигантских клеток: цитоплазма соседних клеток сливается вследствие растворения клеточных оболочек и образуется одна большая клетка со многими ядрами (вирус ПГ-3, чумы крупного рогатого скота и др.);

2) с ее помощью в культуре клеток можно обнаружить некоторые вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами: вирусы ПГ-3, гриппа и др. реакцией гемадсорбции. Гемадсорбцией называется прилипание (адсорбция) эритроцитов крови на поверхности клеток, зараженных вирусом. Этот метод широко используется при диагностике ПГ-3 крупного рогатого скота, при этом используют эритроциты морской свинки;

3) методом образования «бляшек». Этот метод технически сложнее других и применяется главным образом для титрования и клонирования вирусов;

4) обнаружения вируса в РИФ. В том случае, если размножение вирусов в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить при помощи флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при диагностике классической чумы свиней, парвовирусных инфекций, бешенства и др.;

5) иммунопероксидазной реакцией;

6) путем обнаружения внутриклеточных включений. Для выявления телец-включений культуру клеток выращивают на покровных стеклах, помещенных в пробирки, заражают испытуемым материалом и через определенные сроки инкубации (при 37 °С), стекла промывают, фиксируют и окрашивают различными методами (гематоксилин-эозином, акридиновым оранжевым и др.).

Размножающиеся в культурах клеток вирусы частично или полностью (в зависимости от степени разрушения клеток) выходят в культуральную жидкость, которая и используется как готовая суспензия вируса. Если не все клетки культуры разрушились в результате размножения в них вируса, то их разрушают путем 2—3-кратного замораживания и оттаивания или ультразвуком.

Применение культуры клеток

Прежде чем Вы решите использовать в качестве объекта или средства исследования клеточные культуры, Вы должны убедиться, что те преимущества, которые Вы при этом получаете, перекроют сопряжённые с данным методом трудности.

Некоторые преимущества культуры клеток:

Главное преимущество культивируемых клеток - это возможность прижизненного наблюдения клеток с помощью микроскопа.
Существенно, что при работе с культурами клеток в эксперименте используются здоровые клетки, и они сохраняют жизнеспособность в течение всего эксперимента. При опытах на целом животном состояние почек, например, можно оценить лишь в конце эксперимента, и к тому же обычно лишь качественно.
Культуры клеток представляют собой генетически однородную популяцию клеток, растущих в постоянных условиях. Более того, исследователь может изменять эти условия в определённых пределах, что позволяет ему оценивать влияние на рост клеток самых различных факторов - рН, температуры, концентрации аминокислот, витаминов и др. Рост может быть оценен в течение короткого периода времени либо по увеличению числа или размеров клеток, либо по включению радиоактивных предшественников в клеточную ДНК.
Эти реальные преимущества по сравнению с исследованиями на целых животных ставят клеточные культуры как экспериментальную систему в один ряд с культурами микроорганизмов.
Более того, при работе с культурами клеток существенные результаты могут быть получены при использовании очень небольшого числа клеток. Эксперименты, требующие для выяснения того или иного вопроса использования 100 крыс или 1000 человек, могут быть с равной статистической достоверностью поставлены на 100 культурах на покровных стёклах. Т. о. одна клетка может заменить целую клинику больных. Это является важным преимуществом, когда дело касается человека, и, кроме того, снимает многие этические проблемы, возникающими при необходимости использовать для эксперимента большую группу животных.
Поскольку клетки в культуре легко доступны для различных биохимических манипуляций, то при работе с ними радиоактивные предшественники, яды, гормоны и др. могут быть введены в заданной концентрации и в течение заданного периода. Количество этих соединений может быть на порядок меньше, чем при экспериментах на целом животном. Исчезает также опасность того, что исследуемое соединение метаболизируется печенью, запасается мышцами или экскретируется почками. При использовании клеточных культур, как правило, бывает нетрудно установить, что при определённой концентрации добавленное в культуру вещество находится в контакте с клетками в течение данного периода времени. Это обеспечивает получение реальных значений скорости включения или метаболизма исследуемых соединений.

Культура клеток используется в различных научных и практических областях:

Способность клеток к росту в культуре привела к развитию следующих методов:

  • Клонирование
  • Хранение и слияние клеток
  • Получение и работа с мутантными клетками.
  • Иммунология

Гибридомная технология:

клетки, синтезирующие интересующие ученых антитела, подвергают процедуре слияния с клетками миеломы, которые продуцируют антитела с неизвестной специфичностью.
Полученные гибридомы позволили наладить производство моноклональных антител: мышь иммунизируется неочищенным препаратом антигена и затем клетки её селезёнки гибридизуют с клетками миеломы. Среди полученных гибридных клеток найдётся по крайней мере одна, продуцирующая антитела, специфические к исходному антигену.

Биотехнология:

Культуры клеток могут стать ценным источником гормонов и других секретируемых материалов. Культуры клеток уже сейчас оказываются важными продуцентами видоспецифического противовирусного агента интерферона.

Вирусология и трансформация клеток:

Прогресс в области вирусологии в значительной степени обусловлен возможностью выращивать вирусы в культурах клеток.
В результате применения этих методов выяснилось, что вирусы способны не только инфицировать и убивать клетки, но могут также вызывать изменения в характере роста клеток - феномен, известный как вирусная трансформация клеток. Эти изменения, приводящие к появлению клеток, не реагирующих на своих соседей так, как это характерно для нетрансформированных клеток, вызывают особый интерес в связи с тем, что они могут помочь понять природу трансформации, поскольку сходные изменения, происходящие с клетками in vitro, играют определенную роль в индукции опухоли.
Так как в настоящее время большая часть вирусных заболеваний лечится путем введения антисыворотки, выращивание вирусов имеет важное значение как для идентификации вирусов, так и для их использования в получении вакцины.

Эти задачи решаются в основном с использованием клеточных культур.

Научная электронная библиотека





Рис. 2. Заражение куриного эмбриона на ХАО через естественную воздушную камеру
(по Николау)
Рис. 3. Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость (по Николау)

Заражение через искусственную воздушную камеру применяют чаще первого, так как оно обеспечивает контакт вируссодержащего материала с большей поверхностью ХАО и, следовательно, ведет к образованию большего количества вируса. Для заражения эмбриона этим методом его помещают в штатив горизонтально зародышем вверх. В скорлупе делают два отверстия: одно небольшое над центром воздушной камеры (предназначено для отсасывания из нее воздуха), а другое диаметром 0,2-0,5 см сбоку, со стороны зародыша. Сложность метода в том, что, делая второе отверстие, необходимо осторожно снять вначале кусочек скорлупы, затем скользящим движением, не повреждая ХАО, сдвинуть подскорлупную оболочку в сторону так, чтобы через образовавшийся дефект мог пройти воздух. После этого резиновой грушей через первое отверстие отсасывают воздух из естественной воздушной камеры (рис. 4, а). В результате через боковое отверстие наружный воздух устремляется внутрь, образуя искусственную воздушную камеру, дном которой является ХАО (рис. 4, б).

,

Рис. 4. Заражение куриного эмбриона на ХАО через искусственную воздушную камеру (по Николау и др.)
Через боковое отверстие на поверхность ХАО наносят инфекционную жидкость и отверстие закрывают кусочком лейкопластыря. Закрывать первое отверстие нет необходимости, так как внутренний листок подскорлупной оболочки при этом методе заражения не нарушается и продолжает выполнять роль барьера для микрофлоры окружающей среды.
Дальнейшую инкубацию эмбрионов, зараженных этим методом, проводят в горизонтальном положении боковым отверстием вверх.
Заражение в желточный мешок. Большей частью им пользуются для размножения хламидий, а также вирусов болезни Марека, ринопневмонии лошадей, катаральной лихорадки овец и др. Заражают эмбрионы 5-7-дневного, а иногда и 2-3-дневного возраста (вирус лихорадки долины РИФ). Используют два варианта заражения (рис. 6).

Рис. 5. Заражение куриного эмбриона в амниотическую полость (по Николау и др.)
Рис. 6. Заражение куриного эмбриона в желточный мешок (по Николау и др.)

Первый вариант. Иногда путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном в штативе эмбрионе, при этом зародыш находится внизу, а желток - над ним. Отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного парафина.
Второй вариант. Эмбрионы помещают в штатив в вертикальном положении. Делают отверстие в скорлупе над центром воздушной камеры и вводят иглу на глубину 3,5-4 см под углом 45° к вертикальной оси в направлении, противоположном месту нахождения зародыша.
Заражение в амниотическую полость. Для этой цели используют эмбрионы 6-10-дневного возраста. Метод используется при культивировании вирусов гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей и др. Есть два способа заражжения (рис. 5).
Закрытый способ. Заражение проводят в затемненном боксе. Яйцо помещают на овоскопе в горизонтальном положении зародышем вверх. Через отверстие в скорлупе над воздушной камерой вводят иглу с затупленным концом по направлению к зародышу. Доказательством того, что игла проникла в амнион, служит движение тела зародыша в направлении передвижения.
Открытый способ. Скорлупу над воздушной камерой срезают так, чтобы образовалось окно диаметром 1,5-2,5 см. Через него пинцетом под контролем глаза снимают подскорлупную оболочку. Затем анатомический (14 см) пинцет с сомкнутыми браншами ведут, продавливая хорионаллантоисную оболочку по направлению к зародышу. Когда пинцет достигнет его, бранши размыкают, захватывают амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну. Удерживая левой рукой пинцет с фиксированной в нем оболочкой амниона, вводят вируссодержащий материал (рис. 7). Далее все оболочки опускают, окно закрывают лейкопластырем и эмбрион инкубируют в вертикальном положении.
Заражение в тело зародыша. Для заражения используют эмбрионы 7-12-дневного возраста. Известно два варианта метода.
Первый вариант. Заражают так же, как в амнион закрытым способом, с той лишь разницей, что берут острую иглу и на овоскопе показателем попадания иглы в тело считают подчинение зародыша движениям иглы.
Второй вариант. Заражают так же, как в амнион открытым способом: через окно в скорлупе подтягивают пинцетом тело зародыша. Материал вводят в головной мозг или определенные участки тела. При таких методах заражения бывает значительный процент неспецифической гибели эмбрионов.

Рис. 7. Заражение куриного эмбриона в амнион открытым способом (по Николау и др.)

Заражение в кровеносные сосуды ХАО. При овоскопировании 11-13-дневных эмбрионов отмечают крупный кровеносный сосуд. По его ходу удаляют участок скорлупы, наносят 1-2 капли спирта, что делает на некоторое время подскорлупную оболочку прозрачной. Под контролем глаза на овоскопе иглу вводят в сосуд, что подтверждается его подвижностью при небольших боковых движениях иглы. Обнаженный участок подскорлупной оболочки закрывают кусочком лейкопластыря.
Можно материал в сосуды ввести и несколько отличающимся способом. Срезают скорлупу над воздушной камерой, подскорлупную оболочку смачивают спиртом и в ставшие видными сосуды ХАО вводят материал. Отверстие закрывают кусочком стерильного лейкопластыря.
Описанные технические приемы экспериментального заражения куриных эмбрионов не единственные, а имеют различные варианты.
Перед дальнейшей инкубацией на скорлупе зараженных любым методом куриных эмбрионов простым (графитным) карандашом пишут, чем заражен эмбрион и когда, а если нужно, то и другие сведения. Зараженные куриные эмбрионы помещают в термостат для дальнейшей инкубации, в процессе которой происходят репродукция внесенных вирусов и их накопление в соответствующих структурах. Температура инкубации эмбрионов варьирует от 33 до 38 °С в зависимости от свойств вируса, которым проведено
заражение.
За эмбрионами ведут постоянное наблюдение, просматривают на овоскопе, отбирая павшие.
Гибель эмбрионов в первые 24 ч после заражения чаще всего обусловлена размножением грибов, бактериальной микрофлоры, внесенных в эмбрион вместе с инокулятом, или травмированием при заражении. Эта гибель считается неспецифической. В более поздние сроки эмбрионы гибнут в результате, как правило, размножения в эмбрионах вируса. Обнаружив погибшие эмбрионы, их сразу же переносят в холодильник с температурой 4 °С. Такие условия, с одной стороны, способствуют сохранению активности накопившегося в эмбрионе вируса, с другой - уплотнению тканей и запустению сосудов, что значительно облегчает последующее вскрытие.
Эмбрионы инкубируют до момента максимального накопления вируса. Для каждого вируса и даже штамма этот срок является определенным и варьирует в пределах от 2 до 7-8 сут. Так, для вируса ньюкаслской болезни штамма Н он составляет 2-3 дня, для того же вируса штамма В - 5 дней, для вируса инфекционного ларинготрахеита птиц - 5 дней и т.д. Затем все эмбрионы умерщвляют охлаждением при 4 °С в течение не менее 3-4 ч и вскрывают.
Признаки размножения вируса в курином эмбрионе. Показателем заражения эмбриона вирусом может служить его гибель в характерные для данного вируса сроки. Другой признак размножения вируса - патологоанатомические изменения, появляющиеся в различных структурах эмбриона. Так, ХАО может быть отечной, иметь кровоизлияния, узелки, или, как их называют, оспины. Такого рода поражения наблюдаются при заражении куриных эмбрионов вирусами оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауески и некоторыми другими. При этом размер и морфология оспин заметно различаются при размножении разных вирусов. Сам зародыш может отставать в росте и развитии от незараженных, т.е. проявлять феномен карликовости. Тело его может быть в разной степени обезвожено или мумифицировано, шея характерно перекручена. Названные признаки характерны для инфекционного бронхита кур. Кожа зародыша может быть гиперемирована, с кровоизлияниями. Внутренние органы также могут иметь признаки размножения вируса. Например, набухшая желто-зеленого или темно-зеленого цвета печень куриного эмбриона - признак размножения в нем вируса гепатита утят.
Встречаются вирусы (например, штамм В, вируса ньюкаслской болезни), которые, размножаясь в куриных эмбрионах, не вызывают ни их гибели, ни патологоанатомических изменений. Обнаружить такой вирус можно лишь в том случае, если он обладает способностью агглютинировать эритроциты, т.е. с помощью реакции гемагглютинации (РГА). Явление гемагглютинации представляет собой соединение эритроцитов в хлопья при добавлении к ним суспензии гемагглютинирующего вируса. Гемагглютинирующими свойствами обладают те вирусы, вирионы которых имеют на поверхности рецепторы, способные взаимодействовать с рецепторами оболочек эритроцитов. Такие вирионы адсорбируются на поверхности эритроцитов. Адсорбция одного вириона одновременно на двух эритроцитах ведет к тому, что последние оказываются соединенными между собой, а адсорбировавшийся вирион играет роль мостика между ними. Образованием таких мостиков между многими эритроцитами и объясняется склеивание эритроцитов в хлопья.
Образование хлопьев, видимых невооруженным глазом, можно наблюдать при смешивании капли суспензии вируса с каплей отмытых эритроцитов на плоской поверхности (стекла, керамики и др.). При смешивании суспензии эритроцитов и вируса в пробирке хлопья эритроцитов оседают ровным слоем на дно в форме так называемого зонтика.
РГА используют для обнаружения и титрования вирусов. Хлопья эритроцитов появляются через 5-10 мин после смешивания капли вируссодержащей жидкости и капли взвеси эритроцитов. Положительная гемагглютинация не только указывает на присутствие вируса, но и выявляет его гемагглютинирующую активность с определенным видом эритроцитов, что может служить вспомогательным диагностическим признаком.
Нередко при вскрытии эмбриона не удается обнаружить ни одного признака размножения вируса, хотя он и находится в исследуемом материале. Такой пассаж, как уже говорилось, называется «слепым».
Вскрытие куриного эмбриона и получение вируссодержащего материала. Вскрывают куриные эмбрионы с целью обнаружения признаков размножения в них вирусов и получения вируссодержащего материала. Последнее требует соблюдения правил асептики при вскрытии.
В зависимости от того, каким вирусом был заражен эмбрион (а значит, в какой структуре он накопился соответственно тропизму), вируссодержащим материалом могут служить ХАО, ткани зародыша, желточный мешок (его стенки), а также аллантоисная и амниотическая жидкости. В последнем случае выделение вируса наиболее удобно, так как экстраэмбриональные (аллантоисная, амниотическая) жидкости представляют, по существу, готовую суспензию вируса. Перед вскрытием скорлупу эмбриона обрабатывают йодированным спиртом (иногда еще фламбируют). Вскрытие производят в боксе, пользуясь стерильными инструментами и посудой. Скорлупу срезают над той воздушной камерой (естественной или искусственной), через которую заражали.
При этом яйцо держат под некоторым углом, чтобы скорлупа не упала внутрь. Ножницы не должны касаться и повреждать лежащую под воздушной камерой оболочку, для этого срез должен проходить несколько выше границы воздушной камеры.
Обнажившуюся ХАО осматривают, приподнимая ее пинцетом с целью установления в ней патологоанатомических изменений. Часть ХАО, на которую был нанесен вируссодержащий материал, имеет обычно наиболее выраженные изменения. Для более тщательного осмотра ее и взятия этой части приподнимают пинцетом ХАО в этом месте и срезают ножницами как возможно больше. Для осмотра и взятия всей ХАО удаляют зародыш, желточный мешок и белок, а хорионаллантоисную оболочку отслаивают от внутренней поверхности скорлупы, извлекают и переносят в стерильную чашку Петри с физраствором. Оболочку отполаскивают, а затем двумя пинцетами расправляют так, чтобы она лежала в один слой и могла быть осмотрена по всей поверхности. Для того чтобы патологоанатомические изменения оболочки были видны более отчетливо, под чашку Петри подкладывают лист черной
бумаги.
Аллантоисную жидкость в количестве до 10 мл отсасывают пипеткой, которой прокалывают подскорлупную оболочку и ХАО над телом зародыша (рис. 8). Такое направление пипетки предотвращает случайный разрыв стенки желточного мешка и смешивание его содержимого с набираемой аллантоисной жидкостью.
Амниотической жидкости удается отсосать до 1 мл. Для этого после удаления аллантоисной жидкости пипетку вводят в амнион между головой и телом зародыша под его шеей (рис. 9).

Рис. 8. Отсасывание аллантоисной жидкости (по Николау)
Рис. 9. Отсасывание амниотической жидкости (по Николау и др.)

Для получения стенки желточного мешка как вируссодержащего материала желток извлекают на чашку Петри, стенку его разрезают ножницами и отполаскивают от содержимого в физиологическом растворе. Тело зародыша извлекают, удерживая его за шею (рис. 10).
При вскрытии куриных эмбрионов ставят бактериологический контроль вируссодержащего материала посевом на МПБ, МПА, МППБ и среду Сабуро. Вируссодержащий материал хранят при минус 25 °С и ниже.
Культивирование с производственными целями на куриных эмбрионах применяется для размножения ряда вирусов (осповакцины, клещевого энцефалита, гриппа, москитной лихорадки и др.). Так, для изготовления гриппозной и оспенной вакцин используют вирусы, размноженные на хорионаллантоисной оболочке, вакцины против москитной лихорадки - в аллантоисной полости, а вирус клещевого энцефалита культивируют в желточном мешке.
Метод размножения вирусов на культурах тканей
Для изготовления живых и инактированных вакцин вирусы размножаются на первичных культурах тканей, а диагностических препаратов также и на перевиваемых культурах.
Для размножения вирусов предложен ряд методов с использованием культур тканей. Такие методы, как Карреля-Берреуза (1910), культивирование кусочков ткани, фиксированных в сгустке плазмы, Меттлендов (1928) - культивирование в переживающих тканях - в настоящее время не используются не только в производстве, но и в исследовательской работе. Эти методы вытеснены культивированием в однослойной культуре клеток.
Работа по культивированию клеток производится в специальных лабораториях при соблюдении высоких требований к стерильности воздуха, посуды, растворов, питательных сред. Используемая посуда должна быть нейтральной, хорошо вымытой и обезжиренной, применяемые реактивы - химически чистыми.

Культивирование вирусов в питательных средах

Культивирование вирусов

Культивирование вирусов представляет собой их выращивание в искусственных условиях. Для этого культиваторы заражают животных, либо ткани и клетки. Такое мероприятие проводят в целях диагностики, при проведении экспериментов, с целью изготовления противовирусных вакцин.

Культивирование вируса впервые было совершено Гальтье в 1879 году. Он культивировал вирус бешенства, заразив мозг кролика вирусом бешенства, полученным у больной собаки. Ученым Левенштейном была обнародована информация о возможности передачи вируса герпеса от человека кролику.

Репродуцирование вирусом осуществляется исключительно в живых клетках. По этой причине для того, чтобы они накопились, их заражают вирусами. После заражения вирус адаптируется к новому организму. Адаптация вируса проходит тем легче, чем ближе новая среда.

Чтобы репродукция прошла на лучшем уровне используют чувствительную систему, а заражение проводят свежим, но разведенным материалом. Это объясняется тем, что инактивированный вирус может приостанавливать скорость размножения вирионов. Система, в которой осуществляется репродукция, называется пермиссивной. Но, однако для каждого вируса пермиссивная система может приобрести статус непермиссивной. Это будет возможно в случае изменения условий культивирования. К примеру, таким условием являются температурные скачки.

Культивирование вируса на животных осуществляется только в том случае, ели эти вирусы приводят к формированию ясной и понятной клинической картины, либо патологоанатомической картины. Например, во время заражения мышей вирусом бешенства у них случается паралич. Большое количество вирусов хорошо вырастают в птичьих эмбрионах либо теле новорожденных млекопитающих. Реже в организме половозрелых особей.

Культивируют вирус в организмах мышей, крыс, кроликов, кур. На взрослых особях мышей выращивают вирусы гриппа и бешенства.

На белых крысах и хомяках испытывают онкогенные вирусы. Вирус ящура и маргбурской болезни культивируют на морских свинках. Ученые смогли изучить вирусы полиомиелита и желтой лихорадки только после того, как изучили их рост на макаках.

Возбудителей некоторых инфекций ученые смогли определить только после заражения шимпанзе. К таковым относят вирусы гепатита А и В.

Чтобы ученые получили верные результаты все животные, в организме которых культивируют вирусы, должны быть генетически однородными. Для достижения этой цели осуществляют скрещивание лабораторных особей. Результатом такого действия становится растущая степень гомозиготности.

Чтобы культивирование прошло успешно, мало выбора правильного вида и возраста животного. Очень важно, какой будет использован путь для введения материала. Чаще всего вирусы вводят в чувствительные ткани. Лишь малая часть вирусов патогенна для животных независимо от способов введения.

Большая часть нейротропных вирусов выращивают путем введения их в левое и правое полушарие головного мозга животных. Так происходит дело с культивированием вируса у мышей. Кроликам, мышам, овцам, собакам и другим животным аналогичным образом вводят вирус бешенства. Очень часто для культивирования вирусов использую и другой путь: через брюшную полость. Но по чувствительности такой способ уступает введению в головной мозг. Респираторные вирусы чаще вводят в организм интраназальным путем, то есть закапывают в нос или распыляют в виде аэрозоля.

На сирийских хомячках культивируют аденовирус. Вводят его под кожу или в слизистую. В мышцу, через рот, в вену и через анальное отверстие вирусы вводят изредка. Внутривенное заражение произвести с грызунами и другими маленькими животными очень сложно. Вместо этого вирусы вводят прямо в сердечную мышцу.

Осложняется культивирование вирусов в организме животных наличием внутри иных вирусов и бактерий. Иногда случается такое, что вирус в организме животного вырабатывает иммунитет к новому культивируемому.

Чтобы снизить вероятность загрязнения культивируемых вирусов для введения материала используют выращенных в изоляции животных. Для этого выбирают животных, у матерей которых нет в организме инфекций, передающихся от матери к плоду. Новорожденных детенышей извлекают из тела матери, вводят в кишечник специальные молочнокислые бактерии. Для вскармливания таких малышей необходимы SPF самки. Затем уже между такими животными размножение осуществляется тем же путем. Содержатся малыши в закрытых помещениях, в которых осуществляется подача воздуха, свежей пищи и воды.

Животные, в организме которых не имеется никаких возбудителей, содержатся в специально отведенных боксах, в строгой изоляции.

Для культивирования вирусов подходят эмбрионы птиц. Для того, чтобы получить нужные результаты, необходимо правильно выбрать особь, ее вид и возраст, путь заражения и дозу. Температура инкубации играет также немаловажную роль. Из эмбрионов птиц чаще всего используют кур. Их организм до 13 дня отличается повышенной чувствительностью. Хорошо размножаются вирусы в желточном мешке, трахее и легких.

Независимо от пути заражения эмбрионы могут быть травмированы. По этой причине гибель эмбрионов в течение суток после заражения вирусов, ученые не расценивают, как особенную. Обычно для размножения вируса в эмбрионе необходима температура от 36 до 37 градусов. Но для некоторых вирусных клеток необходима температура 40 градусов и выше.

Размножаясь в организме эмбрионов вирусы могут приводить к гибели первых. Большую часть известных науке вирусов выращивают не только в организмах животных, но и в культурах клеток и тканей. В большинстве случаев для этих целей используют клеточные культуры на стекле. Суспензионные культуры используют очень редко. Адаптация вируса проходит легче к первичным культурам клеток, нежели к прививаемым. Для размножения человеческих вирусов лучше всего подходят клетки человека или почечные клетки обезьян.

Доза для вируса при заражении должна составлять от 0,1 до 0,001 пятидесяти процентов тканевой цитопатической дозы вируса на клетку. При это объем вводимого материала должен быть невелик. Через пару часов адсорбируют вирус, только после этого в случае токсичности инокулят удаляют.

При размножении большинства вирусов наблюдаются цитопатические изменения. При дегенерации ¾ клеток в культуре наблюдают максимальное содержание вируса. Размножение вирусов, которые не обладают таким свойством, можно установить при помощи реакции гемадсорбции, путем проведения опытов на животных.

Большая часть вирусных клеток после размножения выходят в культуральную среду, другие же так и остаются связаны с клетками. Некоторые герпетические вирусы пересевают наравне с неповрежденными клетками. Это обусловлено тем, что при разрушении последних осуществляется их инактивация. В некоторых случаях взаимодействие вируса и клетки приводит к развитию хронической болезни.

Чтобы вырастить коронавирус человека, а также другие вирусы берут тканевые культуры. Чаще всего для этих целей используют ткани трахеи кролика. Понять о том, что вирус размножается можно по прекращению движения ресничек культуры ткани.

Нельзя забывать о том, что в культурах клеток и тканей могут быть вирусы и микоплазмы. Попасть туда они могут различным способом.

Для того, чтобы произошла адаптация вируса в искусственно созданных условиях, необходимо проведение нескольких пассажей. Чаще всего они последовательны при введении небольшого количества материала. Во время такой процедуры интенсивность культивирования вируса только растет. Адаптировавшись к одной системе, вирусы часто приобретают возможность размножаться в других системах. Те вирусы, которые выделены недавно, обладают повышенной пластичностью, нежели те, которые долго культивировались в других условиях.

Следствием культивирования вируса в искусственных условиях становится уменьшение их патогенности для естественных владельцев. Такое их свойство положено в основу вакцинации. Если условия культивирования неблагоприятны, то в результате процесса могут появляться дефектные вирусные частицы. В них может содержаться лишь некоторая часть генома. Существуют вирусы, которые в искусственной среде культивировать и вовсе нельзя. После нескольких пассажей их репродукция прекращается.

Вирусы сохраняют в особых условиях. Температура среды не должна быть меньше 4 градусов, а кислотность должна быть равна 7.0. При низкой температуре -70 и ниже вирусы сохраняются отлично. Для этого их помещают в плотно закрытые сосуды. При таких условиях хранения многие из них могут живут годами.

Вирус оспы и энтеровирус хорошо хранится при температуре -20 градусов. Замораживают их быстро. Для их сохранения к среде добавляют стабилизаторы, которые на каждый вирус действуют неоднозначно.

После лиофилизации вирусы могут жить на протяжении длительного промежутка времени. Стабилизаторы, которые применяют: молоко, пептон или куриный желток. Сохранение лиофилизированного вируса должно осуществляться в вакууме или нейтральном газе.

Внимание! Компания Медика Групп занимается продажей автоматических микробиологических анализаторов и флаконов с питательными средами, но не оказывает услуги по сбору или расшифровке результатов анализов крови.

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.

Читайте также: